PEMERIKSAAN BAKTERI ( Prof. Soeminto )

Pendahuluan

•       Bakteri dapat diperoleh dari mana-mana,

–      Dari rongga mulut                                            bahkan dpt ditemukan dari;

–      Dari sela-sela gigi                                              air sumur/minum, dan makanan

–      Dari tanah banyak sampah

–      Sisa-sisa makanan yg sudah basi

•       Biasanya kita awali dengan biakan  di dalam cawan petri (petri dish) yang berisi zat makanan atau medium.

•       Dengan membiarkan medium dalam cawan petri terbuka sela-ma ± 24 jam, akan kita dapati berpuluh-puluh koloni bakteri dan jamur (cendawan) menutup permukaan medium tersebut.

•       Rebusan kentang yang sudah dikuliti, maupun jenang dodol, dapat digunakan sebagai medium sederhana

•       Koloni cendawan segera dpt dibedakan dari koloni bakteri; kolo ni cendawan memperlihatkan benang-benang miselium. Koloni bakteri nampak seperti sekelumit mentega, air susu atau percik-an sari buah yang kental, spt ada tetes minyak diatas air.  

•       Untuk mengetahui sifat morfologi bakteri, maka dapat diperiksa di dalam keadaan hidup atau mati.

•       Pemeriksaan morfologi  diperlukan untuk mengenali nama bak teri→ identifikasi

•       Diperlukan juga pengenalan sifat-sifat fisiologinya, bahkan sifat-sifat fisiologi kebanyakan  merupakan faktor penentu dlm mengenali nama spesies atau bakteri.

Pemeriksaan bakteri dalam keadaan hidup

•       Pemeriksaan bakteri hidup harus dikerjakan dengan hati-hati, lebih-lebih jika yang akan diperiksa bakteri patogen

•       Untuk mengetahui tingkah laku bakteri, biasanya dilakukan pengamat-an bakteri pada tetes bergantung (“hunger droping”), dengan memper-gunakan peralatan:

•       Selembar gelas penutup (cover glass) yang bersih

•       Selembar gelas benda (gelas obyek) bercekungan ditengah-tengahnya

•       Kawat inokulasi (jarum ose) kawat lurus panjang ± 10 cm, ѳ < 0,5 mm,   bergagang  kayu satu ujung dan ujung lain-nya dilengkung melingkar

•       Kawat inokulasi untuk memindahkan mikro organisme dari satu tem-pat ke tempat yang lain. Sebaiknya dibuat dari kawat yang tidak mudah berkarat dan tidak terlalu lemas

•       Mikroskop cahaya

•       Lampu bunsen berisi spiritus, yang dinyalakan. Dengan api  untuk mem-buat ujung ose membara setiap kali akan dipakai memindahkan bakteri. Sebelum, dan sesudah digunakan harus  disterilkan

•       Satu tindakan untuk mesterilkan jarum ose tersebut

•       Enkass; tempat inokulasi suci hama sederhana

Gambar 1.a kaca penutup dengan setetes suspensi bakteri. B. Ialah a dalam posisi

Terbalik diatas cekungan gelas obyek c d. Sediaan yang siap diperiksa (diamati) de

Ngan mikroskop,e. Lampu bunsen, f. Jarum ose (jarum inokulasi), g. Tabung berisi

Biakan bakteri. (dwidjoseputro, 1998, dasar-dasar mikrobiologi, gbr 1, hal 13)

Gambar enkas, dengan dinding dibuat dari fiberglass 

Gambar laminar air flow 

Pemeriksaan bakteri dalam keadaan hidup

•       Keuntungan penggunaan metode hunger-drop adalah:

•       Bakteri berada terkurung  di dalam cekungan gelas obyek, se-hingga bahaya kemungkinan tersebarnya ke lingkungan sekitar hampir tidak ada

•       Bakteri dpt bergerak leluasa, jika yg diamati adalah bakteri yg suka bergerak. Tidak semua spesies bakteri dpt bergerak

•       Cara lain untuk mengamati bakteri hidup adalah dengan tetes-an medium yang tidak menggantung. Caranya lebih mudah, ti-dak diperlukan gelas obyek yang bercekungan di tengah, cukup dengan gelas obyek datar biasa.

•       Kawat inokulasi (jarum ose) yg telah membawa bakteri, disen-tuhkan atau dioleskan ditengah-tengah gelas obyek kemudian ditutup dengan gelas penutup, sebagai sediaan yg siap dipe-riksa. Sediaan seperti ini kurang aman, dan tidak memberikan kebebasan gerak bakteri

Pemeriksaan bakteri dalam keadaan mati

•       Sediakan sebuah gelas obyek yang bersih (diseka dengan alkohol 70%).

•       Ambil sedikit sampel bakteri yg dipiara dalam medium cair , atau dari suatu koloni yg terdapat pada medium padat.

•       Pengambilan dengan jarum ose seperti yg telah disebutkan sebelum-nya. Apuskan ujung jarum ose yg telah membawa bakteri di tengah-2 gelas obyek bersih, sehingga terjadi suatu pembidangan seluas ± 1 cm². Jika jarum ose diposisikan agak sejajar dengan permukaan gelas benda penggesekan dapat lebih mudah dan lebih merata, sehingga bakteri tidak dlm posisi bertimbun pada suatu tempat tertentiu

•       Bila sampel (contoh) bakteri diambil dari koloni pada medium padat, sebelum diapuskan, permukaan gelas obyek tersebut dilumuri air dulu sebelum jarum ose dioleskan/diapuskan. Tdk ada air dipermukaan gelas obyek bila sampel bakteri diambil dr piaraan dlm medium air.

•       Tunggu sampai apusan agak mengering diudara, kemudian gelas obyek lewatkan diatas nyala api, perlahan-lahan sampai apus menjadi kering. Usahakan agar supaya apus bakteri tidak kena api langsung, jadi yg dikenakan api adalah bidang dataran gelas obyek yg tidak di apus 

Pemeriksaan bakteri dalam keadaan mati

•       Jika apusan bakteri sudah kering benar, dapat dimulai prosedur pewarnaan bakteri

•       Ada banyak sekali metode pewarnaan bakteri, tetapi yang lazim dipakai hanya sekitar 12 metode saja

•       Bakteri hidup tidak tampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologik lainnya

•       Bakteri tunggal, yaitu yg hanya berupa satu sel saja, nampak hanya be-ning, walau bakteri tersebut berasal dari koloni yg mempunyai warna tertentu

•       Untuk memperlihatkan inti atau bahan-bahan , ada pewarnaan sendiri, untuk flagel ada cara lain, demikian pula pewarnaan untuk memperli-hatkan spora

•       Cara mewarnai, diusulkan oleh para cerdik pandai, sehingga metode pewarnaan sering disebut menurut nama sarjana yg menemukan; misal pewarna inti disebut pewarna feulgen. Pewarna giemsa, pewarna gram, pewarna neisser, dan lain-lain

•       Pewarna yg digunakan , biru methilin, merah safranin, dsb. Zat pewar-na yang digunakan bisa bersifat asam, netral atau basa. 

Petunjuk umum untuk mewarnai bakteri

•       Bakteri harus diambil dari suatu biakan yg masih muda, ± umur 24 jam; sebagai usia yg baik untuk memperlihatkan bentuk mor-fologinya. Jika diinginkan melihat bakteri membentuk spora, diperlukan bakteri yg lebih tua, yaitu dari biakan berumur 2 s.d. 3  kali 24 jam.

•       Bakteri diratakan di atas gelas obyek yang benar-benar bersih, seluas sekitar 1 cm². Hindari pengambilan bakteri terlalu ba-nyak, karena akan menyebabkan terjadinya penumpukan yang akan menyulitkan pada pengamatan bentuknya. Harus dibuat apus tipis, sehingga dapat diperoleh sediaan satu per satu bak-teri, yang dapat memperlihatkan bentuk bakteri tersebut. 

•       Jika apus sudah kering, sediaan perlu dilewatkan di atas nyala api perlahan-lahan, agar bakteri benar-benar melekat pada ge-las obyek, dengan demikian tidak akan terhapus bila sediaan dicuci. Jaga agar bidang yang mengandung bakteri tidak kena nyala api.

•       Zat pewarna, yg dalam bentuk larutan, diteteskan pada bidang yang mengandung bakteri. Atau gelas obyek direndam seluruh-nya miring pada larutan zat pewarna, tergantung pada sifat khusus zat pewarna, dan kadang-kadang bergantung pada ba-nyak sedikitnya gelas obyek (sediaan) yang harus dibuat. Diberi waktu beberapa lama agar diserap oleh bakteri yg sudah kering tersebut, yg bergantung pada sifat khas zat pewarna yg diguna-kan

•       Selanjutnya sediaan dicuci dengan alkohol atau asam encer, untuk menghilangkan zat warna yang berlebihan. Alkohol yg digunakan untuk mencuci dapat berupa larutan 15% hingga 90% kadang-kadang diperlukan juga alkohol 100% (alkhol absolut). Caranya mencuci, cukup dengan mencelupkansediaan ke dalam alkohol atau ke dalam asam encer dengan tidak usah diusap ataupun digesek. Ada pula zat pewarna yng cukup dicuci dengan air murni atau air biasa dari kran.

•       Sediaan ditunggu kering lagi, temperatur kamar.jika sudah ke-ring, sediaan dapat diperiksa dengan mikroskop, bila perlu dng menggunakan minyak cedar (oli imersi atau minyak celup). Jika dikehendaki, sediaan dapat ditutup dengan gelas penutup (co-ver glass) sebelum ditempatkan di atas meja mikroskop.

•       Sediaan yg diinginkan untuk disimpan lama, perlu perlakuan sebagai berikut:

•       Permukaan yg mengadung bakteri ditetesi balsem kanada, ke-mudian ditutup dengan gelas penutup yg bersih, dengan catat-an sebelum balsem kanada  kering betul, sediaan jangan dile-takkan miring dan sesudah balsem kanada betul-2 kering, sedi-aan dapat disimpan dalam kotak penyimpanan dlm posisi miring

•       Selanjutnya sediaan (preparat) disimpan dalam gelap dan sejuk, agar zat pewarna tdk lekas luntur.

Tahan asam, gram positif dan gram negatif

•       Ada kalanya, setelah suatu sediaan yang sudah menyerap zat pewarna tertentu, kemudian dicuci dengan asam encer, maka seluruh zat pewarna terhapus. Pewarnaan gagal

•       Ada juga sediaan yg tahan terhadap asam encer, misal basil-ba-sil tbc dan basil-basil berspora. Maka dikatakan, bakteri terse-but adalah bakteri tahan asam, ini merupakan ciri khas spesies

•       Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai 2 kali. Setelah zat pe-warna pertama (ungu)terserap, maka sediaan dicuci dng alko-hol, kemudian ditumpangi dengan zat pewarna yg berlainan, yaitu pewarna merah.

•       Jika kemudian sediaan ini dicuci dengan air lalu dengan alko-hol, maka 2 kemungkinan bisa terjadi

•       Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yg tampak ia-lah zat pewarna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) dise-but gram positif.

Dinding sel gram positif dan gram negatif

•       Gram positip

•       Mengandung berlapis-lapis pep tidoglican

•       Mengandung asam teikhoat yg tersusun antara lain oleh glise rol dan fosfat

•       Asam teikhoat bermuatan nega tif, ada 2 tipe

•       Asam lipoteikhoat, merupakan transmembran yg berhubungan dengan membran

•       Teikhoat dinding sel yg berhu bungan dengan peptidoglikan

•       Gram negatip

•       Memiliki 1-2 lapis peptido glikan

•       Memiliki membran luar

•       Peptidoglikan berhubungan de ngan lipoprotein pada membran luar

•       Membran luar mengandung;

•       Lipopolisakarida

•       Lipoprotein

•       Fosfolipid

Konsep pewarnaan gram

•       Sediaan diwarnai gentian violet 3 menit (ungu)

•       Direndam lugol 45 detik

•       Dicuci dng alkohol 95% sampai tidak ada yang luntur

•       Cuci dengan air mengalir

•       Warnai dengan fuchsin (merah) 3 menit

•       Cuci dengan air mengalir

•       Keringkan diantara 2 kertas saring

•       Amati dengan mikroskop

•       Sediaan berwarna ungu → gram positip

•       Sediaan berwarna merah→gram negatif

•       Untuk gram positif warna gentian violet tidak terlarut oleh alko-hol 95%, pewarna ini terserap sungguh-sungguh pada dinding sel

•       Untuk gran negatif, dinding selnya tidak menyerap warna gentian violet

•       Penemu pewarnaan ini christian gram

•       Kemungkinan ke-2, zat warna tambahan (merah) bertahan, hingga zat warna asli tidak nampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) disebut gram negatif.

•       Ada pula bakteri yg pada usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negatif atau sebaliknya. Bakteri yang demikian disebut gram variabel. Jumlah bakteri gram variabel tidak banyak.

•       Bakteri gram positif lebih peka terhadap fenol, penisilin dan resisten terhadap streptomisin

•       Ciri yang khas ini dipergunakan dalam penggolongan bakteri.